2×Pfu PCR Master Mix（含染料） PCR相關(guān)
本產(chǎn)品包含Pfu DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液，濃度為2×。 保真度是Taq酶的54倍，用于高保真PCR反應(yīng)、復(fù)雜模板如GC含量高(>60%)， 有二級結(jié)構(gòu)等的擴增和大規(guī)模的基因檢測。2×Pfu PCR Master Mix（含染料） PCR相關(guān)
2× PFU PCR Master Mix(含染料)
2×Pfu PCR Master Mix（含染料） PCR相關(guān)
目錄號：71111
產(chǎn)品內(nèi)容
產(chǎn)品成份 | 71111-05 | 71111-0100 |
2× PFU PCR Master Mix | 5x 1ml | 100x 1ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 2 年。經(jīng)常使用，可置于 4 °C 保存，有效期 3 個月。
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品包含Pfu DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液，濃度為2×。 保真度是Taq酶的54倍，用于高保真PCR反應(yīng)、復(fù)雜模板如GC含量高(>60%)， 有二級結(jié)構(gòu)等的擴增和大規(guī)模的基因檢測。
PCR產(chǎn)物為平末端，純化后可直接用于Blunt載體克隆。
本產(chǎn)品含紅色示蹤染料，不需添加上樣緩沖液即可直接上樣進行電泳；也可經(jīng)過純化處理，以用于酶切、連接、測序等后續(xù)操作。
適用范圍：
高保真DNA擴增:如表達基因的克隆、基因的定點突變、細胞內(nèi)基因點突變的分析(SNP)和末端補平。
基因檢測：適合大規(guī)?；驒z測，半定量PCR實驗和微量DNA的檢測。
產(chǎn)品特點
具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可最大限度的減少人為誤差。
2 × Pfu PCR Master Mix 使用說明：
一、配制 PCR 反應(yīng)體系：(于冰上配制)
Component | 20 μlReaction | 50 μl Reaction | FinalConcentration |
2× Pfu PCR Mix | 10 μl | 25 μ | 1 × |
Forward Primer (10 μM) | 0.4 μ | 1 μl | 0.2 μM |
Reverse Primer(10 μM) | 0.4 μ | 1 μl | 0.2 μM |
Template DNA | asrequired | as required | |
ddH2O | up to 20 μl | up to 50 μ |
參考模板用量（50 μl 反應(yīng)體系）：
具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)
質(zhì)粒：0.1-10 ng；細菌基因組：10-100 ng；人類基因組：50-150 ng；cDNA：1-5 μl 。
二、建議 PCR 循環(huán)條件：
Step | Temperature | Time | Cycle Number |
Initialdenaturation | 94℃ | 3 minutes | |
Denaturation | 94℃ | 10 seconds |
25-35 cycles |
Annealing | 55℃ | 10 seconds | |
Extension | 72℃ | 0.5-1kb / min | |
Final Extension | 72℃ | 5 minutes | |
4-8℃ | Hold |
注意：如果擴增片段≤4 kb，建議延伸速度為 1kb / min；片段＞4 kb，建議 0.5kb / min。
注意事項：
a. Pfu酶具有3′-5′的外切酶活性，所以Pfu酶擴增時延伸速度比Taq酶低，應(yīng)根據(jù)擴增產(chǎn)物的長度設(shè)置相應(yīng)的延伸時間，如果擴增片段小于4 kb，建議Pfu酶的延伸速度為1kb/ min；如果擴增片段大于4 kb，建議延伸速度為0.5kb / min。同時Pfu酶的3′-5′的外切酶活性可能降解引物， 所以應(yīng)先加dNTP后，再加Pfu酶到反應(yīng)體系中，并立即進行PCR反應(yīng)。
b. 用Pfu酶擴增時，引物的純度要求較高，引物長度大于18個堿基，Tm在55－80℃ 之間，引物濃度在0.1-0.5 μM之間，比Taq酶略高。
c. Pfu酶的熱穩(wěn)定性比Taq酶好，對于GC含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃，對Pfu酶的活性無影響。
三、結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后取 5 µl 反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2×Pfu PCR Master Mix（含染料） PCR相關(guān)
